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蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠

蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠
英文名稱:Protein AG-Berpharose FF
貨號(hào):B2834
規(guī)格:1ml
本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用,不做其它用途!

產(chǎn)品型號(hào):

更新時(shí)間:2025-02-13

蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠


英文名稱:Protein AG-Berpharose FF


貨號(hào):B2834


規(guī)格:1ml


產(chǎn)品介紹

蛋白A蛋白G瓊脂糖凝膠FF是將重組蛋白A蛋白G融合蛋白鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的親和分離介質(zhì)。同單獨(dú)的蛋白A或蛋白G分離介質(zhì)相比,具有更寬廣的結(jié)合范圍,同時(shí)融合后的r-PAG降低了對(duì)pH值的依賴,允許在pH5-8進(jìn)行結(jié)合。本產(chǎn)品多用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究,及抗體固定及其它相關(guān)研究。


規(guī)格

1ml(預(yù)裝柱)、5ml(預(yù)裝柱)、10ml(預(yù)裝柱)、25ml、100ml、500ml 純化流程


以免疫共沉淀(Co-IP)舉例:


結(jié)合緩沖液:20mM磷酸緩沖液、150mMNaCl、pH7.0


洗脫緩沖液:0.1M甘-氨酸,PH3.0


中和緩沖液:1 M Tris-HCl,pH 8.5


(注:所用過(guò)柱液體在使用之前建議用至少小于等于0.45μm濾膜過(guò)濾)


(1)樣品預(yù)處理:細(xì)胞、植物、動(dòng)物組織裂解液樣品,最終總蛋白濃度選擇在0.5-1.0ug/ul范圍內(nèi)為宜,上樣前要確保樣品溶液擁有合適的離子強(qiáng)度和pH值(如:可以用結(jié)合緩沖液對(duì)樣品液進(jìn)行稀釋或透析);哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有多種成分可以和IgG發(fā)生結(jié)合,可能會(huì)在后續(xù)免疫印跡中出現(xiàn)非特異性條帶,可通過(guò)加入Normal IgG和Protein AG-Berpharose FF的方式預(yù)處理裂解液樣品,以降低非特異性結(jié)合。


(2)抗原-抗體復(fù)合物制備:將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合,室溫震蕩孵育30-60min(或4-8度孵育過(guò)夜),形成抗原-抗體復(fù)合物(可根據(jù)已優(yōu)化好的抗原抗體結(jié)合條件處理)。


(注意:抗體的加入量要依據(jù)填料量,抗體的加入量過(guò)多會(huì)影響到抗原-抗體混合物與填料的結(jié)合,故建議抗體加入量為填料載量的80%)


(3)填料平衡:取適量的Protein AG Berpharose FF加入到2ml離心管中,500 r離心1min,棄上清,加入0.5ml結(jié)合緩沖液,懸浮填料,500 r離心1min,棄上清,重復(fù)兩次。


(4)抗原-抗體復(fù)合物的吸附:將抗原-抗體復(fù)合物加入到平衡好的填料中,均勻,在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管,促使樣品和填料充分接觸并吸附,約30min后,500 r離心1min,取上清液,留樣檢測(cè)。


(5)除雜清洗:向上述離心管中加入0.5ml的結(jié)合緩沖液,懸浮填料,進(jìn)行清洗,500 r離心1min,吸棄上清,重復(fù)兩次。


(6)抗原洗脫:


①非變性洗脫法(洗脫的樣品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析):向離心管中加入5倍柱體積的洗脫緩沖液,用移液器吹打5次,混勻,然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管10min后,500 r離心1min,吸取上清液,收集洗脫組分,即為目標(biāo)抗原,收集上清液至新的離心管中,并立即加入十分之一體積的中和緩沖液中和緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性,用于后期功能分析。


     ②變性洗脫法(洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測(cè)):向離心管中加入25ul  1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均        勻,95℃加熱5min。然后進(jìn)行離心,200 r離心1min,收集上清液,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行 Western分析。


蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠


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