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免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測(cè)

上海信帆代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,,免疫組織,特殊染色,病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)等等!我們擁有的實(shí)驗(yàn)室,客戶檢測(cè)項(xiàng)目均提供實(shí)驗(yàn)室儀器型號(hào),提供操作詳細(xì)步驟.歡迎!免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測(cè)

產(chǎn)品型號(hào):

更新時(shí)間:2025-02-06

所有產(chǎn)品僅供科研使用,不能用于食用和醫(yī)療等

免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測(cè)

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting),它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一種研究DNA 結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白,目前已用于研究RNA 結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

Western blot 檢測(cè) 1400元/膜每張膜1--8樣本
EMSA   2800元/膜 每張膜1--8樣本,包括探針及試劑


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Western Blot實(shí)驗(yàn)
成功完成Western Blot檢測(cè),必須滿足4個(gè)條件:

凝膠洗脫:轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來,如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中,將無法在膜上進(jìn)行分析

吸附到膜上:在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上,如果蛋白不吸附,將無法在膜上進(jìn)行分析

處理期間仍截留在膜上:在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近:被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測(cè)試劑接觸,如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測(cè)

成功進(jìn)行WB檢測(cè),則設(shè)置合適正確的對(duì)照是*的,只要正確設(shè)置了這些對(duì)照,即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在,并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性!一般需要設(shè)置的對(duì)照如下:

陽性對(duì)照:明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞,用于檢測(cè)抗體的工作效率

陰性對(duì)照:明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞,用于檢測(cè)抗體的特異性

二抗對(duì)照:不加一抗,用于檢測(cè)二抗的特異性

內(nèi)參對(duì)照:檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對(duì)照:不加一抗和二抗;用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果

WB 檢測(cè)基本過程

1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物

1)根據(jù)檢測(cè)蛋白的位置選擇合適的裂解buffer:

蛋白位置
buffer
全細(xì)胞
NP-40 or RIPA
胞漿(可溶性蛋白)
Tris-HCl
胞漿(骨架結(jié)合蛋白)
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取試劑盒
線粒體蛋白
RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性!

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用,進(jìn)行免疫沉淀(IP)或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質(zhì)

根據(jù)待測(cè)蛋白狀態(tài)確定電泳條件:

待測(cè)蛋白狀態(tài)
凝膠條件
上樣buffer
電泳buffer
Reduced - Denatured
還原,變性
含β-巰基乙醇或DTT,含SDS
含SDS
Reduced - Native
還原,不變性
含β-巰基乙醇或DTT,不含SDS
不含SDS
Oxidized - Denatured
不還原,變性
不含β-巰基乙醇或DTT,含SDS
含SDS
Oxidized - Native
不還原,不變性
不含β-巰基乙醇或DTT,不含SDS
不含SDS

根據(jù)待測(cè)蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量(kDa)
凝膠濃度(%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8

4 、轉(zhuǎn)膜

根據(jù)不同的檢測(cè)目的和待測(cè)蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜(NC膜)和尼龍膜,其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下:

 
PVDF膜
NC膜
尼龍膜
靈敏度和分辨率



背景


較高
蛋白結(jié)合能力
100-200ug/cm2(適用于SDS存在時(shí)與蛋白結(jié)合)
80-100ug/cm2
>400ug/cm2
機(jī)械強(qiáng)度
強(qiáng)
干的膜易脆
軟而結(jié)實(shí)
溶劑抗性
強(qiáng)


使用前是否需要浸潤(rùn)
100%甲醛潤(rùn)濕
緩沖液潤(rùn)濕
緩沖液潤(rùn)濕
適用染色方法
膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭
膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁
不能用陰離子染料
適用檢測(cè)方法
顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測(cè)
顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性
顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性
適用范圍
普通蛋白WB、糖蛋白檢測(cè)、蛋白質(zhì)測(cè)序、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè)
普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè)。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白
低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測(cè)常用
價(jià)格

較低

5 、封閉

去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn),降低背景。常用的封閉溶液有:含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的選擇成功與否,是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵:選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn):

選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗(說明書有驗(yàn)證)

選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗(說明書有驗(yàn)證)

選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體

免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測(cè)

一抗的保存和使用:

根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存;一般需要將抗體分裝后放入-20度保存,避免反復(fù)凍融。

抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,在4度保存不要超過2周

根據(jù)說明書濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)方法等的差異,說明書的稀釋比例只作參考,需要在說明書的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測(cè),然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有濃度,可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度(1:100-1:3000)。

孵育條件:4°C孵育過夜(一般大于18個(gè)小時(shí)),根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用:WB 過程監(jiān)測(cè)以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)!

WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù):

內(nèi)參名稱
分子量大小
適用范圍
beta-actin
43kDa
胞漿和全細(xì)胞
GAPDH
30-40kDa
胞漿和全細(xì)胞
Tubulin
55kDa
胞漿和全細(xì)胞
VCDA1/Porin
31kDa
線粒體
COXIV
16kDa
線粒體
TBP
38kDa
細(xì)胞核

詳情請(qǐng)參考

7 、二抗孵育

根據(jù)說明書濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有濃度,可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度(1:1000-1:20000)。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)

8 、底物孵育

選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光,靈敏度高且背景低,節(jié)省抗體用量

9 、結(jié)果分析和檢測(cè)

凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)或者暗室曝光到膠片

注意事項(xiàng)
1、 抗體:事先咨詢信帆生物,明確抗體種屬及指標(biāo)名稱,確定我司抗體庫否有該抗體可使用,如有一抗可免費(fèi)提供,如無可由雙方協(xié)商而定,客戶自己購買提供或我公司代購;
2、 標(biāo)本收集與保存:
組織樣品  新鮮組織放入液氮或-70度保存,組織不少于100mg(約綠豆大?。?;
培養(yǎng)細(xì)胞  通過細(xì)胞計(jì)數(shù)取不少于100萬個(gè)細(xì)胞于EP管,加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑,混勻后保存于冰箱(-70℃,避免反復(fù)凍融);
血液細(xì)胞標(biāo)本  以抗凝管保存血樣或以淋巴細(xì)胞分離液分離細(xì)胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑,保存(-70℃可保存,避免反復(fù)凍融)
血清或細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本  離心去掉雜質(zhì)后取上清入EP管,保存(以上4℃可保存15-20天,-70℃可保存,避免反復(fù)凍融)
3 、 樣本運(yùn)輸:可選以下任何的一種方式寄送標(biāo)本
組織樣本、細(xì)胞樣本以干冰運(yùn)輸或加入蛋白保護(hù)劑后加冰袋運(yùn)輸;
細(xì)胞樣本也可以直接快件寄送培養(yǎng)瓶(密封保證不污染,培養(yǎng)液不漏出,細(xì)胞不要長(zhǎng)得太滿,50%左右,灌滿培養(yǎng)液);
血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保證液體不漏出,視路途遠(yuǎn)近2-3天可到達(dá))。

流程:
1、客戶告知實(shí)驗(yàn)分組、編號(hào)、檢測(cè)樣本類型、種屬、指標(biāo),有具體要求請(qǐng)事先說明;
2、簽訂合同,寄送樣本和抗體,如需我方提供抗體請(qǐng)事先說明;
3、客戶支付預(yù)付款,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4、提供原始數(shù)據(jù),分析數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)室儀器型號(hào),所用試劑品牌貨號(hào),圖片,實(shí)驗(yàn)報(bào)告等!

 

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