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明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明書(shū)

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明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明書(shū)

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MMP Zymography Assay Kit (for MMP-2 and MMP-9)
XF-P1700
描述:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解
細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織
重塑等過(guò)程,并參與炎癥、腫瘤、、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9
參與各種生理與病理過(guò)程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視1。
本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基
于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,其靈敏度可達(dá)1 nM,高于ELISA 方法2,其
基本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電
泳, 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深
染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色
而形成透亮區(qū)域,從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供
MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-
9 酶譜及活性,檢測(cè)靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),如果小膠加樣孔為10~15
個(gè),則總計(jì)可檢測(cè)500~750 個(gè)樣品。
適用: 檢測(cè)MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1
nM)。組成與儲(chǔ)存(50 assays):
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC;
2. 10 × Substrate G,50 ml, ?20 oC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋;
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋;
5. SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), 4 oC。
檢測(cè)步驟:
1. 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠:分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE
凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 oC 加熱5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加
入10 × substrate G 并使之稀釋10 倍,混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
2. 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM
Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅
使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽(yáng)
性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing
buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37oC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性
對(duì)照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為
10 小時(shí)或過(guò)夜。
6. 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見(jiàn)SDS-PAGE
凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū))。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置
不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及
活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決
辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。
MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。
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明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明書(shū)
說(shuō)明


1. 10 mM 能夠EDTA *抑制MMP 活性。
2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。
參考文獻(xiàn):
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102,
196–202
SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)P1501
常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度
高,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝膠,
并緩慢搖動(dòng)2h;
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng)2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的
藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過(guò)程需要2~4h,也可脫色過(guò)夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈
的背景);
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對(duì)
凝膠進(jìn)行處理后保存。
安全性:含有甲醇,無(wú)特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。
說(shuō)明:
1. 染色液配方:0.25g考馬斯亮藍(lán)R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用
Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾,于室溫可無(wú)限期保存;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或4 oC 保存,可反復(fù)使用2-4 次。

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