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高鐵血紅蛋白(MetHb)測試盒說明書

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高鐵血紅蛋白(MetHb)測試盒說明書

 

一、實(shí)驗(yàn)儀器:試管、微量移液器、旋渦混勻器、可見分光光度計(jì)(540、602和630nm)

二、適用范圍:本試劑盒可測各種動(dòng)物全血等樣本中高鐵血紅蛋白含量;

三、測定意義:體內(nèi)一氧化氮彌散入血后,很快與氧合血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白(methemoglobin, MetHb),NO與MetHb變化相關(guān),故全血MetHb檢測近年來受到的廣泛重視。同時(shí)血液中高鐵血紅蛋白含量的測定對(duì)接觸芳香族氨基、硝基化合物所引起的中毒性疾病的診斷與治療,有重要的意義。

四、試劑組成及配制

     A.試劑一:血紅蛋白測定濃縮液,1ml X 2支,28℃保存。

               血紅蛋白測定應(yīng)用液的配制:臨用前將濃縮液用雙蒸水1:99稀釋,即100倍稀釋,現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的試劑28℃避光保存,可存放一個(gè)月以上。

     B.試劑二: 高鐵血紅蛋白測定濃縮液,30ml X 1瓶,28℃。

              高鐵血紅蛋白測定應(yīng)用液的配制:  濃縮液:雙蒸水=1:9稀釋,即10倍稀釋,可存放6個(gè)月以上。

     C.試劑三:制作還原血紅蛋白曲線用

               白色粉劑 X 1支,28 ℃避光保存。

               稀釋液,1ml X 1支,28 ℃保存。

              試劑三應(yīng)用液配制:臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液,現(xiàn)用現(xiàn)配,注意避光。

     D.試劑四:制作高鐵血紅蛋白曲線用

               磚紅色粉劑 X 1支,28℃避光保存。

               稀釋液,1ml X 1支,28℃保存。

              試劑四應(yīng)用液配制:臨用前每支粉劑加入1ml稀釋液,現(xiàn)用現(xiàn)配,注意避光

、操作過程:

1、制備抗凝全血:取全血立即加入到肝素抗凝管內(nèi),加蓋封口,輕輕顛倒混勻。

2、血紅蛋白含量的測定:取 0.01ml 全血與 2.5ml 的 100 倍稀釋的試劑一應(yīng)用液(血紅蛋白測定應(yīng)用液),混勻,靜置5分鐘后,1cm光徑,雙蒸水調(diào)零,540nm處測定各管吸光度值。

3、高鐵血紅蛋白測定: 取0.05ml全血,加入2.5ml的試劑二稀釋應(yīng)用液(即高鐵血紅蛋白測定應(yīng)用液),混勻,靜置5分鐘后,1cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測定630nm處及602nm處吸光度值。如果沒有雙波長的分光光度計(jì)則可以先測定各管630nm處吸光度值,然后再測各管602 nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號(hào)不要弄錯(cuò)。

、計(jì)算公式:

①、血紅蛋白含量的計(jì)算:血紅蛋白克數(shù)/=540nm處吸光度值×367.7

②、高鐵血紅蛋白百分比計(jì)算: MetHb% = (A630nmr x A602nm)÷(A602nm x(R r)) ×100%

③、高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算:高鐵血紅蛋白克數(shù) / = MetHb%×血紅蛋白克數(shù)/

【注1】 A630即在630nm波長時(shí)樣本的吸光度值;A602即在602nm波長時(shí)樣本的吸光度值

【注2】 R與r均為常數(shù),R=1.81;r=0.14。(本研究所測定常數(shù))

即計(jì)算公式可以簡化為:

①、高鐵血紅蛋白百分比: MetHb% = (A630nm0.14×A602nm) ÷(A602nm ×1.67) ×100%

②、高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算:高鐵血紅蛋白克數(shù)/ = MetHb%×血紅蛋白克數(shù) /

 

七、計(jì)算舉例:

①、取吸煙人全血,立即加入到肝素抗凝管,加蓋封口,輕輕顛倒混勻。

、取該全血0.01ml與2.5ml的100倍稀釋的試劑一應(yīng)用液(血紅蛋白測定應(yīng)用液),混勻,靜置5分鐘后,1cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測定吸光度值為0.373,則通過公式可計(jì)算出血紅蛋白含量。

    血紅蛋白含量計(jì)算:血紅蛋白克數(shù)/升=540nm處吸光度值x 367.7 =0.373 X367.7=137.15克/升

、再取該全血0.05ml,加入2.5ml的試劑二稀釋應(yīng)用液(即高鐵血紅蛋白測定應(yīng)用液),混勻,靜置5分鐘后,1cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測得602nm處的吸光度值為0.226,測定管630nm處的吸光度值為0.066,通過公式可計(jì)算出高鐵血紅蛋白百分比:

高鐵血紅蛋白百分比計(jì)算:MetHb%=(A630nm- r×A602nm)÷(A602nm x(R- r)) ×100%

=(0.066-0.14x0.226)÷(0.226x1.67)x100%=9.10%

高鐵血紅蛋白含量的計(jì)算:高鐵血紅蛋白克數(shù)/= MetHb%X血紅蛋白克數(shù)/

                                          =0.091x137.15/=12.486/

八、注意事項(xiàng):

①、取血后應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn),否則影響測定結(jié)果,因?yàn)榧t細(xì)胞中的還原酶可使高鐵血紅蛋白逐漸還原,使結(jié)果降低。但可放-20℃以下冷凍保存,如果血樣較多,可將全血分成幾小管,每次測試可取其一小管,每次測試可取其一小管,余下各管仍保存-20℃以下以備重復(fù)測試,其結(jié)果不受影響。

②、本實(shí)驗(yàn)可用雙波長分光光度計(jì)測定,可同時(shí)測定602nm處及630nm處吸光度值,進(jìn)行計(jì)算。也可用單波長分光光度計(jì)測定,可以先測定各管630nm處吸光度值,然后再測各管602nm處吸光度值。但一定要注意各管的編號(hào)不要弄錯(cuò)。

③如果實(shí)驗(yàn)室分光光度計(jì)沒有雙波長掃描功能,可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接用本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。R與r均為常數(shù),R=1.81;r=0.14

4所用器皿要干凈。

 
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