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葡萄糖氧化酶試劑盒說(shuō)明書(shū)

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葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 /24
正式測(cè)定前取 2-3 個(gè)預(yù)期差異的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
GODEC 1.1.3.4)廣泛存在于動(dòng)物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并產(chǎn)生 H2O2,
是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。
測(cè)定原理
GOD 催化產(chǎn)生 H2O2,過(guò)氧化物酶催化 H2O2氧化 4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,
500 nm 有特征吸收峰,顏色深淺與 GOD 活性成線(xiàn)性關(guān)系。
試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸
餾水
試劑的組成和配制
提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;
緩沖液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用;用不完的試劑 4
保存一個(gè)月;
試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用;用不完的試劑 4
保存一個(gè)月;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL
取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);
8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,
加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 500nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 試劑一和試劑二的配制:參見(jiàn)試劑的組成和配制。
3、煮沸樣本的準(zhǔn)備:取 500μL 樣本至新的 EP 管中,95℃水浴 10min,冷卻至室溫后,8000g
4℃離心 10min,取上清作為對(duì)照管的煮沸樣本待測(cè)。
4、測(cè)定操作表
試劑(μL)    對(duì)照管    測(cè)定管
樣本                              250
煮沸樣本          250
試劑一             375        375
試劑二             375        375
混勻,35'C 保溫 15min 后,于 500nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度。ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)
定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。GOD 活力單位的計(jì)算
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 2.8348x - 0.0169x H2O2標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y
為ΔA。
1、血清(漿)GOD 活力的計(jì)算
單位定義mL 血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個(gè)酶活力單位。
GODnmol/min/mL= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷V ÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)
2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織 GOD 活力的計(jì)算
1)按蛋白濃度計(jì)算
單位定義mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個(gè)酶活力單位。
GODnmol/min/mg prot=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(V ×Cpr) ×1000÷T
=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr
2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個(gè)酶活力單位。
GODnmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(W×V ÷V 樣總) ×1000÷T
=58.8×(ΔA+0.0169)÷W
3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義:每一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個(gè)酶活力單位。
GODnmol/min/104 cell=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(500×V ÷V 樣總) ×1000÷T
=0.118×(ΔA+0.0169)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.625mLV 樣:加入樣本體積,0.25mL;V 樣總:加入提取
液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;
500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)

 
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