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植物中脂氧合酶(LOX)活性測定試劑盒

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測定意義:

LOX廣泛存在于植物組織中,催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng),導(dǎo)致膜脂過氧化。在植物的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。

測定原理:

LOX催化亞油酸氧化,氧化產(chǎn)物在234nm處有特征吸收峰;測定234nm吸光度增加速率,來計(jì)算LOX活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入2mL試劑二,充分溶解。

粗酶液提?。?/span>

稱取約0.1g樣品,加試劑一1mL,冰上充分研磨,16000g 4離心20min,取上清液待測。

測定:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到234 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25水浴中預(yù)熱30 min以上。

3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于234nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A1A2

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于234nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A3A4。

LOX活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U

LOX (U/mg prot) = [(A4A3)(A2A1)]×V反總÷(Cpr×V)÷T×1000= 10 000×[(A4A3)(A2A1)]÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25中每克樣品每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U。

LOX (U/g 鮮重) = [(A4A3)(A2A1)]×V反總÷(V÷V樣總×W)÷T×1000= 10 000×[(A4A3)(A2A1)]÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,需另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4LV樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mLW 樣品質(zhì)量;V樣總:上清液總體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U

LOX (U/mg prot) = [(A4A3)(A2A1)]×V反總÷(Cpr×V)÷T×1000= 10 000×[(A4A3)(A2A1)]÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U。

LOX (U/g 鮮重) = [(A4A3)(A2A1)]×V反總÷(V÷V樣總×W)÷T×1000= 10 000×[(A4A3)(A2A1)]÷W

Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,需另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4LV樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;W 樣品質(zhì)量;V樣總:上清液總體積,1mLT:反應(yīng)時(shí)間。

注意事項(xiàng):

1.試劑三易自發(fā)氧化,從而導(dǎo)致空白管測定值偏高,必須臨用前配制。

2.樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日完成酶活性測定。

 
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