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蛋白質(zhì)測(cè)定的要點(diǎn)

點(diǎn)擊次數(shù):3457     更新時(shí)間:2021-03-12

蛋白質(zhì)測(cè)定的要點(diǎn)

蛋白質(zhì)測(cè)定的原理和方法

一、飲料中蛋白質(zhì)的測(cè)定



1、原理:同“糧油及其制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定”中的常量凱氏定氮法。

2、儀器:同“糧油及其制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定”中的常量凱氏定氮法。

3、試劑:同“糧油及其制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定”中的常量凱氏定氮法。

4、測(cè)定方法:準(zhǔn)確吸取飲料樣品10~20ml,移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中,加入研細(xì)的CuSO40.5g、K2SO410g和濃H2SO420ml,輕輕搖勻,安裝消化裝置,并將其以45°斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。用電爐以小火加熱,待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后,加大火力,保持瓶?jī)?nèi)液體微沸,液體變藍(lán)綠色透明后,再繼續(xù)加熱微沸30min。冷卻,加入200ml蒸餾水,再放冷,加入玻璃珠數(shù)粒以防蒸餾時(shí)爆沸。

二、糧油及其制品中蛋白質(zhì)的測(cè)定

蛋白質(zhì)的測(cè)定方法一般是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化特性來確定的,主要分為兩類:一類是利用蛋白質(zhì)共性的方法,例如凱氏法、雙縮脲法等;另一類是利用蛋白質(zhì)中含有特定氨基酸殘基的方法,例如酚試劑法、紫外光譜吸收法、色素結(jié)合法等。

在糧食品質(zhì)分析中應(yīng)用zui普遍的是凱氏法。該法是1883年由丹麥化學(xué)家凱道爾創(chuàng)立的,適宜于測(cè)定任何形態(tài)的樣品,而且具有很高的準(zhǔn)確度和精密度,一直被作為蛋白質(zhì)定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。近幾年來對(duì)凱氏法進(jìn)行了多方面的改進(jìn),目前正向自動(dòng)檢測(cè)方面發(fā)展。

1、常量凱氏定氮法

1)原理:將含有蛋白質(zhì)的樣品與濃H2SO4共熱,其中的氮變成銨鹽狀態(tài)后再與濃堿作用,放出的氨用酸吸收,滴定剩余的酸,即可算出含氮量。具體測(cè)定步驟可用消化、蒸餾、吸收與滴定來概括。

消化是指將蛋白質(zhì)與濃H2SO4混合加熱,蛋白質(zhì)被分解,其中的碳被氧化成CO2,所含的氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨,并與H2SO4化合形成硫酸銨殘留于消化液中。

2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 =(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O

由于上述反應(yīng)進(jìn)行很慢,消化需要很長(zhǎng)時(shí)間,加入催化劑可加快反應(yīng)速度,CuSO4是常用的催化劑,K2SO4能提高溶液的沸點(diǎn),常將它們混合使用,起加速氧化、促進(jìn)有機(jī)物分解的作用。K2SO4的用量不宜過大,否則溫度過高,生成的(NH4)2SO4會(huì)分解,放出氨,使氮損失。

蒸餾是將消化所得的(NH4)2SO4加堿蒸餾,氨又被釋放出來。

2NaOH+(NH4)2SO4 = 2NH3+Na2SO4+2H2O

需要注意的是加入NaOH溶液要過量,而且要防止樣液中NH3的逸出。可用CuSO4作堿性指示劑,以黑色CuO出現(xiàn)為宜

吸收與滴定是將生成的氨用標(biāo)準(zhǔn)HCl吸收,剩余的未被中和的HCl則用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定。所用HCl的摩爾數(shù)減去滴定所消耗的NaOH的摩爾數(shù),就是被吸收氨的摩爾數(shù)

生成的氨也可直接用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后,指示劑的顏色變化,再用HCl滴定,直至恢復(fù)到原來的氫離子濃度為止,用去HCl的摩爾數(shù)即相當(dāng)于樣品中氨的摩爾數(shù)

2NH3+4H3BO3 = (NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO3

由于各種蛋白質(zhì)中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為16%左右,將氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)乘以蛋白質(zhì)系數(shù),即得粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2)儀器:凱氏燒瓶(500ml)、錐形瓶(250ml)、定管(50ml)、移液管(50ml)、量筒(100ml)、定氮蒸餾裝置

3)試劑:濃、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑:5份1g/l溴甲酚綠乙醇溶液與1份甲基紅乙醇溶液,按5:1體積臨用時(shí)混合、40g/l硼酸吸收液:稱取20g硼酸溶解于500ml熱水中,搖勻備用、0.1000mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液

4)操作方法

準(zhǔn)確稱取固體樣品0.2~2g(半固體樣品2~5g,液體樣品10~20ml),小心移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中,加入研細(xì)的CuSO40.5g,K2SO410g和濃H2SO420ml,輕輕搖勻,安裝消化裝置,并將其以45°斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。用電爐以小火加熱,待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后,加大火力,使瓶?jī)?nèi)液體微沸,液體變藍(lán)綠色透明后,再繼續(xù)加熱微沸30min。冷卻,小心加入200ml蒸餾水,再放冷,加入玻璃珠數(shù)粒以防蒸餾時(shí)爆沸。

將凱氏瓶安裝好蒸餾裝置,塞緊瓶口,冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶?jī)?nèi)預(yù)先裝入50ml40g/l硼酸吸收液及混合指示劑2~3滴)。放松夾子,通過漏斗加入70~80ml400g/LNaOH溶液,并搖動(dòng)凱氏燒瓶,瓶?jī)?nèi)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀后,再加入100ml蒸餾水(從漏斗中加入),夾緊夾子,加熱蒸餾,至氨全部蒸出(餾液約250ml即可),將冷凝管下端提離液面,用蒸餾水沖洗管口,繼續(xù)蒸餾1min,用表面皿接幾滴餾出液,以奈氏試劑檢查,若無紅棕色物生成,表示蒸餾完畢,即可停止加熱。否則應(yīng)繼續(xù)蒸餾。將上述吸收液用0.1000mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定至灰色即為終點(diǎn),記錄HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量。同時(shí)做空白試驗(yàn)(除不加樣品外,其他操作*相同),記錄空白試驗(yàn)消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

5)結(jié)果計(jì)算

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式為w(蛋白質(zhì))=〔M×F×c(v1-v2) ×100〕/(1000×m)=〔F×c(v1-v2) ×1.4〕/ m       式中:      w(蛋白質(zhì))——蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)   m——樣品的質(zhì)量 (g)    M/14——氮的摩爾質(zhì)量 (g/mol) c——HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 (mol/L)  v1——滴定樣品吸收液時(shí)消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)   v2——滴定空白吸收液時(shí)消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)   F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)

蛋白質(zhì)中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為15~17.6%,按16%計(jì)算乘以6.25即為蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。蛋白質(zhì)系數(shù):乳制品為6.38;肉及其制品為6.25;玉米、高粱為6.24;米為5.95;大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83;大豆及其制品為5.71;面粉為5.70;花生為5.46;芝麻、向日葵為5.30

6)注意事項(xiàng)

蒸餾裝置不能漏氣;蒸餾前若加堿量不足,消化液呈藍(lán)色,不生成Cu(OH)2沉淀,此時(shí)需增加NaOH的用量;硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃,否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失,此時(shí)可置于冷水浴中使用;蒸餾完畢后,應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口,再蒸1min后關(guān)掉熱源,否則可能造成吸收液倒吸;所有試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制;消化時(shí)不要用強(qiáng)火,應(yīng)保持和緩沸騰,注意不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶,以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化*;樣品中若含脂肪或糖較多時(shí),消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫,為防止泡沫逸出瓶外,在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱,并不斷搖動(dòng);也可以加入少量的辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑,并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度;當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí),可將凱氏燒瓶冷卻,加入30%(體積分?jǐn)?shù))H2O22~3ml后再繼續(xù)加熱消化;若取樣量,如干試樣超過5g,可按每克試樣5ml的比例增加H2SO4用量;一般消化至呈透明后,繼續(xù)消化30min即可,但對(duì)于含有特別難以消化的氮化合物的樣品,如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí),需延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物若分解*,消化液呈藍(lán)色或淺綠色,但含鐵量多時(shí),呈較深綠色;混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。

2、微量凱氏定氮法

1)原理:同常量凱氏定氮法

2)儀器和用具:凱氏燒瓶(100ml)、萬(wàn)用電爐、微量滴定管(10ml)、移液管(10ml)、容量瓶(100ml)、洗耳球、乳膠管、微量凱氏定氮蒸餾裝置

3)試劑:0.01000 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液:其他試劑同常量凱氏定氮法

4)操作方法:樣品消化步驟同常量凱氏定氮法

將消化*的溶液冷卻后,全部移入100ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻。裝好微量定氮裝置。量取消化稀釋液10ml置于反應(yīng)管內(nèi),經(jīng)漏斗再加入10ml400g/LNaOH溶液使其呈強(qiáng)堿性,用少量蒸餾水沖洗漏斗數(shù)次,夾好漏斗夾,進(jìn)行水蒸氣蒸餾。冷凝管下端預(yù)先插入盛有10ml40g/l(或20 g/l)硼酸吸收液的液面下。蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始計(jì)時(shí),繼續(xù)蒸餾10min后,將冷凝管下端提離液面再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管尖-端后停止蒸餾。餾出液用0.01000 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點(diǎn)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

5)結(jié)果計(jì)算

樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式為

w(蛋白質(zhì))={〔F×c(v1-v2) ×14 ×100〕/1000}/〔(10×m)/100〕

=F×c(v1-v2) ×14/m          式中:      w(蛋白質(zhì))——樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)  m——樣品的質(zhì)量或體積 (g)    14/ M——氮的摩爾質(zhì)量 (g/mol)    c——HCl或 H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量的濃度 (mol/L)      v1——樣品消耗HCl或 H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)     v2——試劑空白消耗HCl或 H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)      F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)

6)說明

         20 g/L硼酸吸收液每次用量25ml,用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2滴;在蒸餾時(shí),蒸汽發(fā)生要均勻充足,蒸餾過程中不得?;饠鄽?,否則將發(fā)生倒吸;加堿要足量,操作要迅速;漏斗應(yīng)采用水封措施,以免氨由此逸出損失;雙試驗(yàn)結(jié)果允許誤差:粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%以下時(shí),不超過0.2%;蒸餾前將水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3體積處,加甲基橙指示劑數(shù)滴及H2SO4數(shù)毫升以使其始終保持酸性,可避免水中的氨被蒸出而影響測(cè)定結(jié)果;粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%以上時(shí),誤差不超過0.4%。求其平均數(shù),即為測(cè)定結(jié)果,測(cè)定結(jié)果取小數(shù)點(diǎn)后一位。

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