如何使用光學顯微鏡

顯微鏡是研究微生物學的重要工具之一，根據(jù)不同的研究目的和要求，可以分別選用普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等，在食品微生物檢測中，以普通光學顯微鏡(簡稱顯微鏡)zui為常用。

光學顯微鏡通常采用兩級放大，分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體位于物鏡的前方，被物鏡做第-一級放大后成，倒立的實像，然后此實像再被目鏡做第二級放大成虛像，人眼看到的就是一虛像，而顯微鏡的總放大倍率就是物鏡放大倍率和目鏡放大倍率的乘積。

光學顯微鏡是利用光學原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細結(jié)構(gòu)信息的光學儀器。光學顯微鏡就是利用表面為曲面的光學透鏡使物體放大成像這一原理，把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。



放大倍率是指直線尺寸的放大比，而不是面積比。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率，顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的zui小間距。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又相互有關(guān)聯(lián)的概念。



當選用的物鏡分辨率不夠高(數(shù)值孔徑不夠大)時，顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu)，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只是一個輪廓大但細節(jié)不清晰的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已經(jīng)滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。



一、顯微鏡的使用方法

（一)對光

(1)鏡檢時身體要正對實驗臺，采取端正的姿態(tài)，調(diào)整兩個目鏡之間的距離與觀測者瞳距相符，兩眼自然睜開，同時左手調(diào)節(jié)焦距，使物像清晰并移動標本視野，右手記錄、繪圖。將低倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方與鏡筒成一直線。鏡檢時載物臺不可傾斜，因為當載物臺傾斜時，液體或油易流出，既損壞了標本，又污染載物臺，也影響檢查結(jié)果。

(2)利用自然光源鏡檢時，zui-好用朝北的光源，不宜采用直射陽光；利用人工光源時，用日光燈的光源。轉(zhuǎn)動底部光源或撥動反光鏡，調(diào)節(jié)視野亮度。反光鏡有平、凹兩面，光源強時用平面，較暗時用凹面，需要強光時，將聚光器提高，光圈放大；需要弱光時，將聚光器降低，或光圈適當縮小。

(3)將待觀察的標本置載物臺上，載物臺上有固定的裝置固定標本(見圖3)。通過載物臺調(diào)節(jié)旋鈕將標本移至鏡筒下方。轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒下降至物鏡 鏡接近標本。于轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋的同時，需俯身在鏡旁仔細觀察物鏡與標本之間的距離。

(4)調(diào)節(jié)目鏡之間距離，雙眼分別于左、右目鏡中觀察，待雙眼視野重合，同時左手轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使鏡筒徐徐上升以調(diào)節(jié)焦距，使視野內(nèi)的物像看到時即停，再調(diào)細準焦螺旋，至標本清晰為止。



(二)物鏡的使用

顯微鏡一般具有三個物鏡，即低倍、高倍及油鏡，固定于物鏡轉(zhuǎn)換盤孔中。觀察標本時，使用低倍物鏡，此時，視野，標本較易查出，但放大倍數(shù)較小(一般放大100倍),較小的物體不易觀察其結(jié)構(gòu)。高倍物鏡放大的倍數(shù)(一般放大400倍),能觀察微小的物體或結(jié)構(gòu)。油鏡放大倍數(shù)可達1000倍，用來觀察細菌。



(三)低倍、高倍、油鏡頭的識別

(1)標明放大倍數(shù)10×、40 ×、100 x，或10/0.25、40/0.65、 100/1.30。

(2)低倍鏡zui短，高倍鏡較長，油鏡zui長。

(3)鏡頭前面的鏡孔低倍鏡zui大，高倍鏡，油鏡zui小。

(4)油鏡頭上?？逃泻谏h(huán)圈，或“Oil"或“油”字



(四)低倍鏡換高倍鏡的使用方法

(1)光線對好后，捻轉(zhuǎn)載物臺調(diào)節(jié)旋鈕尋找需要觀察的標本。

(2)如標本的體積較小，不能清楚查看其構(gòu)造因而不能確認時，則將標本移至視野中央，再旋轉(zhuǎn)高倍物鏡于鏡筒下方。

(3)旋轉(zhuǎn)細準焦螺旋至物象清晰為止。

(4)調(diào)節(jié)聚光器及光圈，使視野內(nèi)的物象達到zui清晰的程度。



(五)油鏡的使用方法

(1)將光線調(diào)至zui強程度(聚光器提高，光圈全部開放，亮度調(diào)節(jié)旋鈕或光源放至zui大）。

(2)將標本固定在載物臺上，先把低倍鏡調(diào)至視野zui亮，并找到標本視野的適當位置，然后才能換用油鏡。

(3)轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒上升，滴香柏油1小滴(不要過多，不要涂開)于物鏡正下方標本上。

(4)轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換盤，使油鏡頭于鏡筒下方。

(5)俯身鏡旁側(cè)面，在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止。但勿使兩者相碰，防止損傷鏡頭或玻片。

(6)慢慢轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使油鏡頭徐徐上升至見到標本的物象為止。

(7)轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，使視野物象達到zui清晰的程度。

(8)左手徐徐移動載物臺調(diào)節(jié)旋鈕，并轉(zhuǎn)動細準焦螺旋以觀察標本。

(9)標本觀察完畢后，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋將鏡筒升起，取下標本玻片。立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈，再用干凈的擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，zui后用干凈的擦鏡紙將鏡頭上的二甲苯擦去。注意在擦鏡紙擦拭時，要求順著一個方向旋轉(zhuǎn)擦拭，不能兩個方向來回擦。



(六)觀察

初學者應(yīng)先用低倍鏡觀察，這是因為低倍鏡視野的實際范圍zui大，易于發(fā)現(xiàn)目的物，將標本玻片放在載物臺上(注意標本朝上),并使標本位于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，同時從側(cè)面觀察，待物鏡下降到標本約0.5cm時，開始由目鏡觀察，同時用粗準焦螺旋升起鏡筒，直到出現(xiàn)物象后，改用細準焦螺旋，上下微微轉(zhuǎn)動，仔細調(diào)節(jié)焦距，直至zui后獲得清晰的物象為止。如此時視野里所觀察到的部位不理想時，可利用載物臺調(diào)節(jié)旋鈕將zui適合的部位移動到視野中央。



由低倍鏡轉(zhuǎn)換到高倍鏡時，一定要從側(cè)面注視，以防低倍鏡未對好焦距而造成鏡頭與玻片相撞，另外要用手指捏住轉(zhuǎn)換器下面的金屬盤使之旋轉(zhuǎn)，而不得用手指捏住物鏡來轉(zhuǎn)動，否則使用后，會使光軸歪斜。調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使亮度適中，再仔細轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象。



細菌或其他標本的細微結(jié)構(gòu)，都需要用油鏡觀察，由于油鏡的工作距離很短(0. 19mm左右),故使用時必須特別小心。在低倍鏡找到要觀察的部位以后，將鏡筒升高，在標本上加一滴香柏油，轉(zhuǎn)換鏡頭，從側(cè)面注視，用粗準焦螺旋將鏡筒小心下降，使油鏡浸入油滴，直到幾乎與標本接觸為止(注意切勿壓在標本上，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡鏡頭)。從目鏡觀察，先用粗準焦螺旋徐徐升起(只準上升鏡筒，不能向下調(diào)節(jié)),當視野中有模糊的標本物象時，改用細準焦螺旋調(diào)節(jié)，直到標本物象清晰為止，如轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋已使鏡頭離開油鏡，應(yīng)重新調(diào)節(jié)，直至調(diào)到看清物象為止。



(七)顯微鏡的保養(yǎng)

(1)移動顯微鏡時，右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，勿傾斜，輕輕取出。不要只用一只手提取，以防顯微鏡墜落。然后輕輕放在實驗臺上。注意在任何情況下都不要嘗試同時拿起兩臺顯微鏡。



(2)顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時與臺面接觸，這樣會導(dǎo)致震動過大，透鏡和細準焦螺旋的裝置易損壞。



(3)顯微鏡須經(jīng)常保持清潔，勿使油污和灰塵附著。如透鏡部分不潔時，用擦鏡紙輕擦，如有油污，將擦鏡紙蘸少許二甲苯拭去。尤其在使用油鏡后。檢驗?zāi)跨R是否干凈的zui-好方法是在使用顯微鏡觀察時，用拇指和手指旋轉(zhuǎn)目鏡，通過鏡頭上的灰塵是否運動來判斷。如果通過清理目鏡上方起不到清除灰塵的效果，就應(yīng)該清理目鏡的下方，并用特殊的空氣罐工具吹走多余的擦鏡紙棉絨。如圖4當目鏡被拿下清理的時候，應(yīng)該用擦鏡紙遮蓋目鏡敞開的部分，用特殊的空氣噴射裝置吹去灰塵和多余的棉絨。



(4)強酸、強堿、酒精、乙醚等都能去漆或損壞機件，需注意不使接觸機件。

(5)顯微鏡不能在陽光下暴曬和使用。

(6)目鏡和物鏡不要隨便抽出和卸下。必須抽取接目鏡時，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。

(7)顯微鏡用完后，取下標本片，經(jīng)聚光器降下，再將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋使鏡筒下降，以免物鏡與聚光器相碰。然后放入鏡箱，或鏡外加蓋塑料防塵罩。

(8)顯微鏡應(yīng)放在干燥的地方，以防生霉。

(9)顯微鏡是貴重的精密儀器，使用時要加以愛惜，切勿隨意拆散玩弄。

二、顯微鏡的光路

目鏡是顯微鏡頂部一個非常復(fù)雜的部件，它由兩個或兩個以上的內(nèi)部透鏡組成，通常擁有10倍的放大倍數(shù)。雖然圖2的顯微鏡示意圖給出的是雙目顯微鏡，但是也有單筒目鏡的顯微鏡。另一個重要的部件是物鏡，通常顯微鏡都有可以旋轉(zhuǎn)的鏡梁，有利于物鏡對玻片的觀察。大部分實驗室的顯微鏡物鏡的放大倍數(shù)通常為:10倍、45倍和100倍，鏡頭上長標記的英文：low power（低倍），high-dry（高倍）和oil immersion (油鏡).有的顯微鏡可能會有四個鏡頭，但是zui小的放大倍數(shù)只有4倍。





顯微鏡的第三個重要部件為聚光器，它位于載物臺下方，收集由燈(光源)發(fā)出的光，射到載玻片。聚光器可以由載物臺下方的一個旋鈕調(diào)節(jié)升降。聚光器中有一個光圈可以調(diào)節(jié)透過光的劑量。如果顯微鏡缺乏電壓來調(diào)節(jié)光源就主要依靠光圈來調(diào)節(jié)光源的強度。圖1所示的Olympus顯微鏡的光圈是通過調(diào)節(jié)一個凸邊的圓圈來調(diào)節(jié)光的強度的。圖2顯示了顯微鏡的光路情況。



三、分辨率

顯微鏡透鏡系統(tǒng)的分辨率取決于光圈的數(shù)值孔徑、光的波長和聚光器的設(shè)計。zui0好的顯微鏡的油鏡的分辨率一般在0.2 um.這就意味著兩個相距0.2 um的物體用顯微鏡觀察就感覺是兩個獨立的個體。但是如果相距小于0.2 um,那么兩個小物體就被認為是一個物體。想要使顯微鏡的分辨率得到zui大的發(fā)揮，以下因素是必須考慮的：

(1)在光源的上方添加藍的濾光片，因為短的藍光波長可以提供更大的分辨率。

(2)聚光器需要放在zui高的位置上，這樣可以使光zui大限度的到達目標處。

(3)光圈不能停在靠下的位置。盡管光圈靠下可以提高對比度，但是它會使光圈的數(shù)值孔徑變小。

(4)油鏡需要在載玻片和100倍的目標之間使用。

必須注意的是放大率增大，分辨率必須增大。但是單純的增加放大率，比如使用20倍目鏡是不能增加分辨率的。



四、顯微鏡的構(gòu)造



(一)光學部分

1.物鏡

該鏡頭下端接近被檢物體，為顯微鏡上的主要光學裝置。由多塊透鏡組成。一般顯微鏡具有3個-4個物鏡，分成干燥系和油鏡兩組，干燥系又按放大倍數(shù)分為低倍鏡和高倍鏡。各物鏡放大率由其外形辨認，鏡頭長度越大，鏡片口徑越小，放大倍數(shù)愈大；反之，放大倍數(shù)小。油鏡頭的下緣，一般刻有一圈黑線。此外，各物鏡上都刻有放大倍數(shù)、孔徑數(shù)等標志



2.目鏡

目鏡重要的光學部分之一，和鏡檢者的眼睛接近。目鏡由兩塊透鏡組成，其上刻有倍數(shù)。為便于指出物象，常在鏡中裝黑色細絲一條，作為指針。



3.聚光器

聚光器位于載物臺下方的次臺上，由數(shù)個透鏡組成。能上下移動，調(diào)節(jié)并集聚由光源提供的光線，使集中于載物玻片上。



4.光源

光源提供觀察所需光線，裝在顯微鏡的zui下方。



(二)機械部分

1.鏡臂

鏡臂在鏡筒后面，便于顯微鏡搬移，并作為將鏡筒傾斜時的握持部。



2.底座

顯微鏡的底座用以支持全鏡，呈馬蹄形。



3.載物臺

在物鏡下方，呈方形或圓形，用以載放被檢物體。中央有孔，可以透光。臺上裝有一彈簧夾，鏡檢時可以固定標本片。有的載物臺上裝有載物臺調(diào)解旋鈕，捻轉(zhuǎn)旋鈕，能使標本前后左右移動。



4.光圈

在聚光器下方，可以任意開閉，用以調(diào)節(jié)射入集光線的多寡。



5.電源和亮度調(diào)節(jié)旋鈕

用于開啟光源和調(diào)節(jié)光源的亮度。



6.粗準焦螺旋和細準焦螺旋

粗準焦螺旋可使載物臺距離地升降。細準焦螺旋可以精確地調(diào)節(jié)距離。