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應(yīng)用液相色譜法

點擊次數(shù):1629     更新時間:2020-11-11

應(yīng)用液相色譜法

提取

將樣品解凍,稱取2.00g,置于50mL聚丙烯離心管,加入磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.16)100μL,用玻璃棒攪勻,再加乙酸乙酯10mL,均質(zhì)機14000rpm均質(zhì)1min,往復(fù)式振蕩器振動10min,3000rpm離心10min,將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15mL具塞刻度試管中,40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL,旋渦混勻30s,振動10min,3000rpm離心10min,將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15mL具塞刻度試管中,40℃以下氮氣吹至5mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液,旋渦混勻1min,加蓋后振動10min,3000rpm離心8min,用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層,在余液中加入正己烷5mL,旋渦混勻30s,3000rpm離心8min,用巴斯德吸管移去正己烷層,0.45μm微孔濾膜過濾,濾液備用。



衍生

向樣品瓶中加入200μL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液,旋渦混勻30s,20min后供液相色譜分析。

色譜分析

取衍生后的樣品提取液20μL進樣,記錄峰面積,響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間定性,內(nèi)標(biāo)法定量?;前奉愃幬锷V分析圖參見附錄A。

工作曲線

稱取空白樣品2.00g,分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL,樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg,按7.2、7.3、7.4操作,以磺胺峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),磺胺含量為橫坐標(biāo),繪制工作曲線。

計算

用色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計算樣品中磺胺殘留量:

式中:

X——樣品中磺胺殘留量,單位為毫克每千克(mg/kg);

s——樣品溶液中磺胺峰面積,單位為counts;

s1——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積,單位為counts;

S——標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺峰面積,單位為counts;

S1——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積,單位為counts;

x——加標(biāo)樣品中磺胺殘留量,單位為毫克每千克(mg/kg)。

方法回收率

濃度范圍為0.010mg/kg~0.10mg/kg時,回收率見回收率表。

回收率表

名稱

回收率

磺胺嘧啶

88.0%~111.8%

磺胺甲基嘧啶

90.0%~110.8%

磺胺二甲基嘧啶

91.0%~110.1%

磺胺甲基異噁唑

107.0%~116.7%

方法檢出限

本方法檢出限為0.010mg/kg。

精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的15%。

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的測定,其它磺胺類藥物的測定可以參照本標(biāo)準(zhǔn)。

規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改-單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn),然而,鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的zui-新版本。凡是不注日期的引用文件,其zui-新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

原理
用乙酸乙酯提取,稀鹽酸反提取,正己烷脫脂,熒光胺衍生,反相色譜柱分離,熒光檢測器檢測,磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)物,內(nèi)標(biāo)法定量。

試劑
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑在磺胺類藥物出峰處應(yīng)無干擾峰,實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水標(biāo)準(zhǔn)。

標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑,磺胺5-甲氧嘧啶,純度均大于98.0%。
丙酮:色譜純。
正己烷:色譜純。
乙酸乙酯:色譜純。
乙腈:色譜純。
甲醇:色譜純。
熒光胺:純度大于99.0%。
乙酸鈉:分析純。
冰乙酸:優(yōu)級純。
鹽酸溶液:2mol/L,量取180mL鹽酸,加適量水并稀釋至1000mL。
乙酸鈉溶液:3.5mol/L,稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中,定容至100mL。
熒光胺溶液:2mg/L,稱取0.03g熒光胺,加15mL丙酮,振搖至*溶解,存放在暗處?,F(xiàn)配現(xiàn)用。
標(biāo)準(zhǔn)儲備液:100mg/L,稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg),用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存,保存期為一個月。
混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:1mg/L,移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00mL,用甲醇稀釋并定容至100mL,在室溫下混勻。
內(nèi)標(biāo)儲備液:100mg/L,稱取磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg),用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存,保存期為一個月。
內(nèi)標(biāo)中間液:1mg/L,移取內(nèi)標(biāo)儲備液1.00mL,用甲醇稀釋并定容至100mL,在室溫下混勻。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL,分別加入內(nèi)標(biāo)中間液100μL,用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL,配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,其中內(nèi)標(biāo)濃度為0.05mg/L。

儀器與設(shè)備
液相色譜儀:配熒光檢測器。
電子天平:感量0.0001g。
電子天平:感量0.01g。
高速組織搗碎機。
均質(zhì)機。
離心機。
旋渦混勻器。
氮吹儀。
往復(fù)式振蕩器。
聚丙烯離心管:15mL、50mL。
容量瓶:10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。
玻璃移液管:1mL、2mL、5mL、10mL。
巴斯德吸管。

色譜條件
色譜柱:ODS-C18,5μm,4.6mm×250mm,或同類型號色譜柱。
柱溫:45℃。
流動相:乙腈 乙酸溶液(38 62),500mL水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0配制成乙酸溶液。
流速:1mL/min
進樣量:20μL。
激發(fā)波長:405nm。
發(fā)射波長:495nm。

步驟分析

樣品制備

從原始樣品中取出部分有代表性的樣品,高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品,混勻,均分成兩份。裝入清潔容器,加封,標(biāo)明標(biāo)記。-18℃以下冷凍保存。

 

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