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組織游離膽固醇測試盒現(xiàn)貨供應(yīng)

點擊次數(shù):1283     更新時間:2019-11-27

組織游離膽固醇測試盒現(xiàn)貨供應(yīng),信帆生物供應(yīng)組織游離膽固醇測試盒,試劑盒備有大量現(xiàn)貨,質(zhì)量穩(wěn)定。

 

組織游離膽固醇測試盒(酶法)(Tissue free cholesterol )

 

描述:在實體組織和細胞內(nèi),膽固醇酯既是構(gòu)成細胞質(zhì)膜的成分,也是細胞內(nèi)脂滴的主要組分。細胞內(nèi)膽固醇過度聚集與動脈粥樣硬化泡沫細胞形成密切相關(guān)。實體組織和細胞的膽固醇測定遠比血液膽固醇測定復雜。本試劑盒避免了有毒的有機溶劑抽提、繁雜的氮氣吹干和脂質(zhì)復溶等步驟,采用能試劑裂解細胞和提取膽固醇,優(yōu)化了酶學反應(yīng)和操作步驟,簡單易行,靈敏度高,線性范圍20~5000 µmol/L。

 

原理:本試劑盒采用WHO、中國《全國檢驗操作規(guī)程》的酶學方法,結(jié)合經(jīng)典GPO Trinder酶學反應(yīng)1,2,原理如下:(1) 膽固醇酯酶分解膽固醇酯為游離膽固醇。(2) 膽固醇氧化酶將游離膽固醇氧化,反應(yīng)過程產(chǎn)生過氧化氫。(3) 在過氧化物酶催化下進行生色反應(yīng),在550nm有大吸收峰,光密度值與膽固醇濃度成正比。

 

適于測定樣品:(1) 動物實體組織     (2) 培養(yǎng)細胞      (3) 細胞膜組分

 

組成 (105次微板測定或30次1 ml比色杯測定):

(1)    裂解液 50 ml    (2)R1試劑 16 ml    (3)R2試劑 4 ml     (4)5 mmol/L膽固醇標準品0.5 ml

 

儲存:4 ºC,儲存三個月

 

所需設(shè)備:酶標儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計。佳工作波長550nm,如無此波長建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

 

操作步驟;

一. 組織細胞裂解:

裂解前,組織或細胞用PBS洗滌2次去除殘存血液或培養(yǎng)基血清,以免影響膽固醇測定。

1)      培養(yǎng)細胞裂解:

消化、離心收集細胞或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x106個細胞,75cm2瓶約1x107細胞。按比例每1x106個細胞加0.1ml裂解液,震蕩混勻,靜置10分鐘。

2)      細胞膜成分:

每5x106細胞制備的細胞膜組分,加入0.1-0.2ml裂解液(應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗調(diào)整裂解液的量),震蕩混勻,靜置10分鐘。

      3)     動物組織裂解:

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進行保存。組織凍存后再進行解凍、剪切、稱重可能會產(chǎn)生嚴重的測量誤差。離心管稱重,加入組織塊后再稱重,二者相減(即減量稱重法)計算組織重量(約100mg)。強烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。(注意;裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提?。S秒妱痈咚賱驖{器或手動玻璃勻漿器破碎組織。(不超聲方法,因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗調(diào)整初始的組織細胞加入量),而后靜置10分鐘。

二. 組織細胞裂解液處理

1.    取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管,進行步驟2的操作。余下的裂解液用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定,或-20ºC儲存。

2.    可選的優(yōu)化步驟:70ºC加熱10分鐘,可能出現(xiàn)絮狀沉淀。(此步驟即可在組織量多、膽固醇含量高時采用)。

3.    室溫2000g離心5分鐘,取上層清液用于酶學測定。

注意:如果得到上清的上層有較多的白色乳濁樣小顆粒,重復步驟2和3。

三、工作溶液配制: 按4:1比例,取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混勻,立即使用或4ºC保存<1天,變色棄去。

四、標準品稀釋:將5 mM膽固醇標準品用無水乙醇稀釋為2500、1250、625、312.5、156、78、39µmol/L。通常稀釋4個點即可。注意設(shè)置零濃度空白對照管。

五、含量測定:

1.    取190 µl工作溶液加入微板。

2.    在各工作液中,分別加入10 µl (5~10µl) 空白對照溶液(無水乙醇或蒸餾水均可)、標準品、待測樣品。樣品體積不可超過20µl。如測量值超過線性范圍可用裂解液稀釋,根據(jù)稀釋倍數(shù)計算濃度。

3.    37ºC或25ºC室溫反應(yīng)20分鐘然后進行測定。(延長反應(yīng)時間可能使游離膽固醇值增加,進而使游離膽固醇的數(shù)值與總膽固醇值接近。)

4.    先用蒸餾水(或無水乙醇)+工作液的空白管調(diào)零,然后測定各管OD值。

5.    繪制標準曲線并計算濃度。

Excel作圖步驟:各標準管OD值為y軸,標準品濃度為x軸。(1)鼠標左鍵圈住數(shù)據(jù),點擊-做圖向?qū)?,選擇-散點圖-,點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點,點擊 -添加趨勢線-,點擊 -選項-,點擊 -顯示公式-和 -R2值-

6.    以每mg蛋白濃度或細胞數(shù)校正膽固醇含量。

  

組織膽固醇酯測定:需同分別測定組織總膽固醇和游離膽固醇,二者的差值即為膽固醇酯含量,參見以下說明。

 

說明:

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。

2. 不同類型的組織細胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇的比例差異很大。延長反應(yīng)時間可能使游離膽固醇值增加因而使其值與總膽固醇值接近。由差值計算求得的膽固醇酯的值,主要適合血液樣品測定,可能不很適合細胞內(nèi)膽固醇酯測定。其原因主要與細胞內(nèi)膽固醇酯和游離膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運、外流、儲存、分解、再酯化等諸多動態(tài)生物過程的非線性的高度復雜性有關(guān),還與現(xiàn)有測量方法的局限性有關(guān)。膽固醇(酯)的含量以及代謝方式在肝細胞、巨噬細胞、肌肉細胞、成纖維細胞等不同類型的細胞中存在巨大差異。有時以差值計算的膽固醇酯出現(xiàn)背離和偏差,甚至為負值。如果出現(xiàn)這種情況,建議在數(shù)據(jù)分析時采用膽固醇酯/總膽固醇比值,而非膽固醇酯值;或者嘗試用同位素標記方法、薄層層析、HPLC等方法測定膽固醇酯,或許會有改善。

 

參考文獻

1、Trinder P. Ann. Clin. Biochem. 1969, 6: 24-27.

   2、Barham D and Trinder P. Analyst. 1972, 97: 142-145

組織游離膽固醇測試盒現(xiàn)貨供應(yīng)

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