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信帆生物:Rt-PCR實驗準(zhǔn)備及與操作步驟

點擊次數(shù):1327     更新時間:2016-05-26

一、實驗器具與材料: 
1、移液槍:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 
2、吸頭:1ml、200μl、20μl 
3、勻漿管:5ml 
4、吸頭臺:放置1ml吸頭的一個,放置20μl吸頭的一個 
5、EP 管:1.5ml、0.2ml、100μl 
6、試劑瓶:2個60ml的棕色試劑瓶(廣口,帶蓋) 
1個125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇) 
7、量筒:50ml、250ml、500ml 
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 
9、試管架:5ml、 1.5ml、20μl 
10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個備用,一個裝無水乙醇,另一個裝DEPC水 
11、鋁制飯盒:4個 
12、塑料小飯盒:1個 
13、大瓷缸:2個 
14、錫泊紙:一卷 
15、卷紙:2卷 
16、三角燒瓶:帶蓋,稍大 


二、實驗器具的處理與準(zhǔn)備 
1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等) 
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過夜,然后高壓,再烤干備用,實驗前將槍頭等放入吸頭臺,再高壓一次(EP管) 
2、玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜,再烤干) 
3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC) 
三、試劑配制: 
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。 
2、75%乙醇:用無水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC 水需先高壓) 
3、異丙醇:放入棕色瓶中 
4、氯仿:放入棕色瓶中 
5、瓊脂糖 
四、幾種緩沖液的配制: 
1、電泳緩沖液: 
Tris 54g 
硼酸 27.5g 
0.5M EDTA 20ml? pH8.0 
蒸溜水 1000ml 
5×TBE (貯存液) 
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用(即工作液濃度),如取50ml貯存液+450ml水--→500ml工作緩沖液 
2、上樣緩沖液: 
0.25%溴酚藍(lán) 
0.25%二甲苯青FF 
30%甘油 
6×緩沖液,4℃保存 
五、瓊脂糖凝膠的配制: 
1、 1.0%: 
1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液,微波爐中火30秒至沸騰,熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠 2.5μl,充分混勻,將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中,在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進行電泳。 
2、1.5%: 
同上,將瓊脂糖的量改為1.5g

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