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信帆生物:CHO細胞表達系統(tǒng)與酵母細胞表達系統(tǒng)比較

點擊次數(shù):2371     更新時間:2016-05-02

1.CHO細胞表達系統(tǒng)
(1)優(yōu)點
CHO細胞屬于成纖維細胞,既可以貼壁生長。也可以懸浮生長。目前常用的CHO細胞包括原始CHO和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(DHFR-)突變株CHO。近年來,為降低生物試劑成本和減少血制品帶來的潛在危害性,動物細胞生物試劑開始使用無血清培養(yǎng)基(SFM),但SFM往往導(dǎo)致細胞活力差,貼壁性差,分泌外源蛋白的能力差等缺點。另有研究者嘗 試將類胰島素生長因子IGF基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級CHO”,無需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素,細胞可在SFM中生長良好。與其他表達系統(tǒng)相比,CHO表達系統(tǒng)具有以下的優(yōu)點:
(1)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能,表達的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面zui接近于天然蛋白分子; 
(2)既可貼壁生長,又可以懸浮培養(yǎng),且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力;
(3)具有重組基因的擴增和表達能力,外源蛋白的整合穩(wěn)定;
(4)具有產(chǎn)物胞外分泌功能,并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白,便于下游產(chǎn)物分離純化;
(5)能以懸浮培養(yǎng)方式或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度培養(yǎng)。且培養(yǎng)體積能達到1000L以上,可以大規(guī)模生物試劑。
(2)存在的問題 
在過去的幾十年里,人類對動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)進行了大量的研究開發(fā),取得了很大進展,但是利用CHO細胞表達外源基因的技術(shù)水平尚不能滿足生物藥品的開發(fā)和生物試劑的要求,目前上游工作中主要存在以下問題:
①構(gòu)建的重組CHO細胞生物試劑效率低,產(chǎn)物濃度亦低;
②某些糖基化表達產(chǎn)物不穩(wěn)定,不易純化;
③重組CHO細胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié),主要表現(xiàn)在上游構(gòu)建時著重考慮它的表達,而對高教表達的產(chǎn)物是否能有效地提取出來,即分離純化過程考慮較少;
④重組細胞培養(yǎng)費用昂貴,自動化水平低下。 

2.畢赤酵母細胞表達系統(tǒng)
(1)特點

自1987年Gregg等在畢赤酵母中表達乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年,已有四十多種外源蛋白在畢赤酵母宿主菌中獲得表達。而zui近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種,且一年比一年多,與其它表達系統(tǒng)相比,畢赤酵母表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢: 
1)含有*的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子,用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達; 
2)表達水平高,即可在胞內(nèi)表達,又可分泌型表達。畢赤酵母中,報道的zui高表達量為破傷風(fēng)毒素C為12g/l,一般大于1g/l。絕大多數(shù)外源基因比在細菌、釀酒酵母、動物細胞中表達水平高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有指導(dǎo)分泌的信號肽序列,使表達的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中,有利于分離純化; 
3)發(fā)酵工藝成熟,易放大。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生物試劑的發(fā)酵工藝,且細胞干重達100g/l以上,表達重組蛋白時,已成功放大到10000升; 
4)培養(yǎng)成本低,產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價,一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇,其余為無機鹽,培養(yǎng)基中不含蛋白,有利于下游產(chǎn)品分離純化;而釀酒酵母所用誘導(dǎo)物一般為價格較高的半乳糖; 
5)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上,隨染色體復(fù)制而復(fù)制,不易丟失; 
6)作為真核表達系統(tǒng),畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu),具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。
(2)存在的問題
盡管甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)被認為是發(fā)展前景的真核表達系統(tǒng),許多表達產(chǎn)物已用于治療及預(yù)防,但它并不是的表達系統(tǒng),作為一種新的表達系統(tǒng),和其它表達系統(tǒng)一樣,巴氏系統(tǒng)也并非盡如人意,同樣有其局限性,仍然存在這樣或那樣的缺陷或不足。如分泌產(chǎn)物的不均一性,包括聚合體的存在,發(fā)酵周期較長,易污染,且長時間的發(fā)酵不利于外源蛋白的表達;利用易燃的甲醇做原料,表達產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮;篩選藥物價格昂貴也給生物試劑應(yīng)用帶來局限;低表達或不表達的例子也在增多。信號肽加工不*,修飾功能欠完善以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象,給外源蛋白的純化和工業(yè)化帶來了困難。而且,與安全可靠、背景清楚的釀酒酵母相比,巴氏系統(tǒng)還有其它缺點:
(1)分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差,要對其進行遺傳學(xué)改造困難。
(2)不是一種食品微生物,發(fā)酵時又要添加甲醇, 所以,要用它來生物試劑藥品或食品還沒有被廣泛接受。
(3)發(fā)酵雖然能達到很高的密度,但是發(fā)酵周期一般較長。
其中zui重要的一個缺陷就是分泌表達的蛋白在培養(yǎng)基中被自身分泌的蛋白酶降解,由于甲醇酵母多采用高密度發(fā)酵,蛋白酶也會隨著細胞密度的增高而增高。
下面三種方法可以在發(fā)酵過程中有效降低外源蛋白的降解:①添加富含氨基酸的添加劑,如:胰蛋白胨,它們可以作為蛋白酶的底物被分解而減少目的蛋白的降解;②改變培養(yǎng)基 pH值,由于畢赤酵母可以在pH值為3.0~7.0的范圍內(nèi)正常生長,調(diào)節(jié) pH值可以改變蛋白酶的活性,從而減少蛋白質(zhì)的降解;③應(yīng)用蛋白酶缺陷型菌株,如:SMD1163、1165、1168。
其次,有些蛋白在畢赤酵母中表達量很低或不表達,原因至今尚未*闡明,但可能與以下幾方面有關(guān):
①畢赤酵母與人及其它物種一樣對所使用的氨基酸密碼子具有不同的偏好性,這可能限制其蛋白質(zhì)翻譯速度。比較 110種酵母基因密碼子使用情況發(fā)現(xiàn),所有基因可分為明顯的兩組:高表達組和低表達組。高表達組基因的密碼子相應(yīng)的tRNA也明顯高于低表達組,第三位密碼子為胞嘧啶的比例也明顯升高,AT含量則比較低。鑒定酵母和人類使用頻率zui低的密碼子發(fā)現(xiàn):8個低頻密碼子中有6個是一樣的,無論大腸桿菌,果蠅,還是酵母和人類,大量表達的蛋白基因中低頻密碼子則明顯減少,低頻密碼子含量高的蛋白質(zhì)大量表達都是對其自身有害的。為了在畢赤酵母中表達HIV-2外殼糖蛋白gpl05,Zhang YJ等將低頻密碼子AGG突變?yōu)橥吹腃GA,編碼天冬氨酸的GAT突變?yōu)榫幋a谷氨酸的 GAA,并引入了酵母偏好的TCC,zui終實現(xiàn)了gpl05在其中的高表達;
②當(dāng)整合拷貝數(shù)增多后,可能在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生后生(Epigenetic)的調(diào)節(jié),影響重組蛋白產(chǎn)率的提高;
③轉(zhuǎn)錄提前終止,這主要是因為AT含量過多引起的。據(jù)報道HIV.1 gpl20就是因為在AT豐富區(qū)因轉(zhuǎn)錄提前終止而不能在畢赤酵母中表達,在釀酒酵母中有一些共有序列,類似于HIV-1gpl20中引起轉(zhuǎn)錄提前終止的AT豐富區(qū)域,如:TTTTATA,當(dāng)改變這些序列后,就可發(fā)現(xiàn)更長的mRNA出現(xiàn)。

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