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PCR實驗小技巧之組織mRNA提取

點擊次數(shù):1311     更新時間:2016-02-17

 一、材料

  水稻葉片或小鼠肝組織。

  二、設備

  研缽,冷凍臺式高速離心機,低溫冰箱,冷凍真空干燥器,紫外檢測儀,電泳儀,電泳槽。

  三、試劑

  1、無RNA酶滅菌水:用將高溫烘烤的玻璃瓶(180℃ 2小時)裝蒸餾水,然后加入0.01%的DEPC(體積/體積),處理過夜后高壓滅菌。

  2、75%乙醇:用DEPC處理水配制75%乙醇,(用高溫滅菌器皿配制),然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中,存放于低溫冰箱。

  3、1×層析柱加樣緩沖液;20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。

  4、洗脫緩沖液:10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。

  四、操作步驟

 ?。ㄒ唬﹦又参锟俁NA提取-Trizol法

  Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析,斑點雜交,Poly(A)+分離,體外翻譯,RNase封阻分析和分子克隆。

  1、將組織在液N中磨成粉末后,再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨,注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。

  2、研磨液室溫放置5分鐘,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒。

  3、取上層水相于一新的離心管,按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘。

  4、棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,渦旋混勻,4℃下7500g離心5分鐘。

  5、小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

  [注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。

  2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

    (二)mRNA提取

  由于mRNA末端含有多poly(A)+,當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上,在低鹽濃度或蒸餾水中,mRNA可被洗下,經過兩次oligo(dT) 纖維素柱,可得到較純的mRNA。

  1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。

  2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床體積為0.5-1.0ml,用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

  3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。

  4、將(一)中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫,加入等體積2x柱層析緩沖液,上樣,立即用滅菌試管收集洗出液,當所有RNA溶液進入柱床后,加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。

  5、測定每一管的OD260,當洗出液中OD為0時,加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液,以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

  6、測定OD260,合并含有RNA的洗脫組分。

  7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。

  8、4℃下12000g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗 滌沉淀,4℃下12000g離心5分鐘。

  9、小心棄去上清液,沉淀空氣干燥10分鐘,或真空干燥10分鐘。

  10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃)。

  [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

  2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈,然后用層析柱加樣緩沖液平衡,并加入0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存,重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。

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