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信帆生物為你詳細(xì)解:WB免疫印跡實驗代測的詳細(xì)操作步驟

點(diǎn)擊次數(shù):6140     更新時間:2015-12-01

一、配膠

注意一定要將玻璃板洗凈,zui后用ddH2O沖洗,將與膠接觸的一面鄉(xiāng)下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外),過濾后作為儲存液避光存放于4度,可至少存放1個月,臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡,有條件者可真空抽吸3分鐘),加入10%AP(0.7~0.8:100,分離 膠濃度越高AP濃度越低,15%的分離膠可用到0.5:100)及TEMED(分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000,濃縮膠用0.8:1000)即可,如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。

封膠:灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠,膠濃度<10%時可用0.1%的SDS封,濃度>10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇,也可以用0.1%的SDS。封膠后切記,勿動。

待膠凝后將封膠液倒掉,如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈,然后加少量0.1%的SDS,目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS,將玻璃板倒立放置片刻控凈。

4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子,注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔,以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠,隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形,可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正;若變形嚴(yán)重,可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣,長時間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成,因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。

(10%的AP現(xiàn)配現(xiàn)用,如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀,棄掉.)

二.樣品處理

1.培養(yǎng)的細(xì)胞(定性):

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。

⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl,60~80℃的1×loading buffer。

⑶ 100℃,1min。

⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min,期間vortex 2~3次。

⑸ 用干凈的針尖挑絲,如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉,如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象,則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min,再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘稠,可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度,便于上樣。

⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。

2.培養(yǎng)的細(xì)胞(定量):

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。

⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,收集在EP管后超聲(100~200w)3s,2次。

⑷ 12000g離心,4℃,2min。

⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度,充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣,剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲存,-70℃一個月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上樣前98℃,3min。

3.組織:

⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫,快速勻漿。

⑵ 12000g離心,4℃,2min。

⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度,充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣,剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲存,-70℃一個月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上樣前98℃,3min。

(裂解液配方:Tris-Cl (pH7.4) 20mM,EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量,且新鮮蛋白很少降解,故可不加,如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。

1×loading buffer配方:10% 甘油,50mM Tris·Cl (pH6.8),2% β-巰基乙醇,0.2~0.5‰溴酚藍(lán),2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×,注意SDS終濃度勿超過10%。

對于心臟,肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS,肝腎等組織2%即可。)

三.電泳

1.上樣前將膠板下的氣泡趕走。

2.所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣,樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loading buffer上樣,Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。

2.以初始電壓為45V時的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳,當(dāng)電壓達(dá)65V時改為穩(wěn)壓電泳。

3.在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結(jié)束。

電泳液配方:Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS(10ml 10% SDS)/L

Tris-base 1.5g, glycine 7.2g, 0.1% SDS(5ml 10% SDS)/0.5L

四.轉(zhuǎn)膜

1.電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備:

濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液:Tris 3.0g,Gly 14.4g, M-OH 200ml,加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液,每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜:將NC膜平鋪于去離子水面,靠毛細(xì)作用自然吸水后再*浸入水中10min以排除氣泡,隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。

2.取膠:

將膠卸下,保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠(以便以后雜其他感興趣的蛋白),左上切角,在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下,置于潔凈玻璃板上,按順序鋪上膜與每側(cè)一張(干轉(zhuǎn)每側(cè)三張)濾紙。注意用玻棒逐出氣泡,剪去濾紙與膜的過多部分(尤其是干轉(zhuǎn),以防止短路)

3.轉(zhuǎn)膜:

濕轉(zhuǎn):電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干,加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上,滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡,封緊后放入電轉(zhuǎn)槽,注意膜在正極一側(cè)。降溫,將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜,或400mA,4h。注意不同蛋白的要求不同。

干轉(zhuǎn):用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極,濾紙吸干,鋪上膠,再滴少許電轉(zhuǎn)液,以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。

電轉(zhuǎn)液配方: Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇/1L

五.封閉及雜交

1.封閉:

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出,去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗,浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色(2%乙酸,0.5%麗春紅的水溶液)觀察蛋白條帶,再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉,如用蛋白marker則可省略此步。

2.結(jié)合一抗:

一抗的準(zhǔn)備:使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作:含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上,將Western膜從封閉液中取出,濾紙貼角稍吸干,正面朝下貼在一抗上,注意不要留下氣泡,室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。

3.洗滌:

一抗孵育結(jié)束后,用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次,每次5-10min。

4.結(jié)合二抗:

根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗,根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體,按相應(yīng)比例稀釋(1:1000~1:10000),室溫輕搖一小時。

5.洗滌:

二抗孵育結(jié)束后,用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次,每次5-10min。

PBST: 1×PBS TTBS: Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃)

Tween-20 0.01% ~0.02% NaCl 150mM

Tween-20 0.05%

封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS,臨用時取200ml PBST或 TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。

六.發(fā)光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1.HRP-ECL發(fā)光法:

將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸干,反貼法覆于A、B混合液滴上,熄燈至可見淡綠色熒光條帶(5min左右)后濾紙貼角吸干,置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中,迅速蓋上膠片,關(guān)閉膠盒,根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1-2min,清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影,清水沖凈晾干,標(biāo)定Marker,進(jìn)行分析與掃描。

2.AP-NBT/BICP顯色法:

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中,使用前將一片分裝在30個 EP管中,每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸干,反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上,并用不透明物體(如報紙)遮擋光線,顯色20s后每10s觀察一次,至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān),當(dāng)然如果暴光時間長達(dá)半小時,出現(xiàn)背景是正常的。

七.增強(qiáng)敏感性

若目的條帶未出現(xiàn),或很淡,可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度:

用清水漂洗膜數(shù)分鐘,重加發(fā)光液進(jìn)行曝光,可延長曝光時間。

將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長,期間至少換2次液。

封閉40~60min

一抗雜交,室溫1h。37℃ 1h 會更強(qiáng),但可能增加非特異條帶。

PBST或TTBS洗膜20min,期間換2次液。

二抗雜交,37℃ 1h。

PBST或TTBS洗膜20min,期間換2次液。

發(fā)光鑒定。

若條帶仍未出現(xiàn)或很淡,可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min,期間換2次液。

10.三抗雜交,室溫1h。37℃ 1h 會更強(qiáng),但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗,比如二抗用羊抗兔,此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。

11.PBST或TTBS洗滌膜20min,期間換2次液。

12.發(fā)光鑒定。

一抗溶液中加入0.2% 疊氮鈉后可4℃存放至少2周(一個月我也用過,沒問題,再長時間還沒試)

八.NC膜的多次使用

一張NC膜可使用多次,對多種蛋白進(jìn)行雜交,步驟與“七.增強(qiáng)敏感性”相近。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計位置差別則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液(10min×3次)后從一抗雜交開始,后續(xù)步驟同前。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計位置較近則需更強(qiáng)的洗滌,可用 strip液(可用雜交袋)于室溫?fù)u動洗滌30min~60min,然后用PBST洗滌10min×3次,再從封閉開始,后續(xù)步驟同前。

對于雜交若干次的膜,如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶,可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液(可用雜交袋)于50℃洗滌30min,然后用PBST洗滌10min×3次,再從封閉開始,后續(xù)步驟同前。

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