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PCR實驗代測的模板濃度

點擊次數(shù):445     更新時間:2024-01-02

PCR實驗代測的模板濃度


 服務(wù)內(nèi)容:


1.制定個性化實驗方案:根據(jù)不同的實驗?zāi)康拇_定實驗方案、選定合適的內(nèi)參;


2.檢測類別:mRNA、miRNA、lncRNA、DNA;


3.樣本抽提及質(zhì)檢:對客戶提供樣本進(jìn)行RNA抽提,并利用NanoDrop進(jìn)行樣本質(zhì)檢;


4.定量PCR預(yù)實驗:包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應(yīng)體系及進(jìn)行Real-TimePCR反應(yīng);


5.正式定量PCR實驗:根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行正式實驗;


6.數(shù)據(jù)分析:采用2- △△CT法進(jìn)行分析,比較不同樣本間差異。


影響Ct值的關(guān)鍵因素


模板濃度


模板濃度是決定Ct的最主要因素??刂圃谝粋€合適范圍內(nèi),使Ct在15-35之間


反應(yīng)液成分的影響


任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。


PCR反應(yīng)的效率


PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來,反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。


Real-time qPCR常見參數(shù)


基線(baseline)通常是3-15個循環(huán)的熒光信號


同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線


閾值(threshold)


自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍


手動設(shè)置:置于指數(shù)擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強


同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。


Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。


分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。


Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。


△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(△Rn=Rn-基線)。


如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果


PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復(fù),至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。


另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2,它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準(zhǔn)確預(yù)測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時,兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。


PCR實驗代測的模板濃度


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